Dlaczego trzeba było myć studnie po każdym kroku?

Mycie dołków mikropłytek po każdym etapie różnych testów biochemicznych i biologii molekularnej, takich jak ELISA (test immunoenzymatyczny), izolacja DNA/RNA, PCR i Western Blot, jest istotną częścią protokołu eksperymentalnego. Celem etapów płukania jest usunięcie resztek odczynników, składników reakcji lub wszelkich zanieczyszczeń, które mogą zakłócać kolejne etapy lub wpływać na dokładność i swoistość testu.

Oto kilka powodów, dla których konieczne są etapy mycia:

Usuwanie niezwiązanych substancji: Etapy płukania po dodaniu odczynników lub przeciwciał pomagają usunąć wszelkie niezwiązane substancje, takie jak nadmiar przeciwciał, nieswoiste cząsteczki wiążące lub składniki reakcji, które nie są wychwytywane lub związane z fazą stałą. Dzięki temu sygnał detekcji jest specyficzny i wolny od zakłóceń tła.

Minimalizacja zanieczyszczeń krzyżowych: Etapy płukania skutecznie zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego pomiędzy próbkami. Jest to szczególnie ważne, gdy jednocześnie przetwarzanych jest wiele próbek, ponieważ zapobiega przenoszeniu składników reakcji lub zanieczyszczeń z jednej studzienki do drugiej. Płukanie pomaga zachować integralność i dokładność wyników poszczególnych próbek.

Skuteczne usuwanie substancji zakłócających: Mycie jest konieczne, aby usunąć substancje, które mogłyby zakłócać dalsze etapy. Na przykład w teście ELISA przemywanie pomaga wyeliminować niezwiązane kompleksy koniugat-przeciwciało, ograniczając w ten sposób powstawanie zabarwienia tła i zwiększając swoistość reakcji kolorymetrycznej. W PCR przemywanie usuwa nukleotydy, startery i polimerazy z poprzednich cykli amplifikacji, minimalizując ryzyko przeniesienia zanieczyszczeń i zapewniając dokładną amplifikację w następnym cyklu.

Standardyzacja i odtwarzalność: Przestrzegając standardowych procedur mycia, badacze zapewniają spójne warunki we wszystkich eksperymentach i w różnych laboratoriach. Ta spójność ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników.

Procedura płukania może obejmować użycie pipety wielokanałowej lub automatycznej myjki do płytek w celu dozowania i zasysania buforu płuczącego. Bufor do przemywania to zazwyczaj buforowany roztwór soli fizjologicznej, który przypomina skład oryginalnego buforu użytego w teście, ale nie zawiera żadnych składników reakcji.

Kluczowe znaczenie ma odpowiednie mycie, bez nadmiernego mycia. Nadmierne przemywanie może spowodować utratę niezbędnych składników związanych z fazą stałą i wpłynąć na czułość testu. Dlatego protokoły przemywania są starannie zaprojektowane, aby zapewnić optymalne usunięcie niepożądanych substancji przy jednoczesnym zachowaniu integralności unieruchomionych cząsteczek lub analitów będących przedmiotem zainteresowania.