Jak przeprowadzić FRET Assay

transferu energii rezonansu fluorescencji ( FRET ) jesttechniką test stosuje się do pomiaru ilości i obecność wiązania pomiędzy dwoma białkami reporterowy związany . Test ten jest zwykle wykorzystywany do analizy potencjalnie wiążące białka w różnych typach komórek, a do pomiaru skuteczności sprzęgania enzymów typu . Urządzenia detekcji potrzebne , zależy w dużej mierze od rodzaju cząsteczek reporterowych są używane , chociaż wiele razyprosta 96- studzienkowego czytnika płytek, może być używany. Rzeczy, które musisz
Protein-of-interest/Reporter cząsteczki białka buduje dla każdego testowanego
oraz bloku 96- 96- płyta
czytnik płytek Obrazów dobrze buforu reakcyjnego ( ogólnie lub Tris - fosforan buforowane -solanka - based)
Koniugacja enzym ( jeśli to konieczne )
Pokaż więcej instrukcji
konfiguracji i czytanie
1

Generowanie lub przygotować konstrukty fuzyjne białka interesie każdego , z których każdy jest połączony z cząsteczką fluorescencyjną - transmisji , takich jak białko zielonej fluorescencji (GFP) , rodamina lub boru - dipyrometanu ( BODIPY ) .
2

Określić absorbancji i emisji długości fal składowych i fluorescencyjnym ogólnie test . (Na przykład, jeślitest mierzy GFP -> transferu energii fluorescencji rodaminy ,długość fali absorpcji wejście jest absorbancji GFP w ( 488 nm) , idetekcja przy długości fali emisji jest, że dla rodaminy (595 nm ) ) Łódź.
3

Tworzenie odpowiedni bufor do reakcji w eksperymencie , w zależności od białka o właściwościach biochemicznych procentowych tych . Bufor TRIS opartejest często używany, w tym chlorek wapnia i 0,05 procent Tween -20 . Specyficzne stężenia i składniki można wyznaczyć przeszukując do pozycji dziennika szczegółowo podobne reakcje i warunki.
4

zmieszać dwa białka reporterowe sprzężonego zainteresowania w różnych stężeniach w buforze reakcyjnym i próbkę 50-200 ul na dołek . Dodawanie enzymu sprzęgania ( np. sortase ) do każdego dołka , jeśli to właściwe. Podczas przeprowadzania testu w punkcie końcowym , pozwalają inkubacji w temperaturze pokojowej ( lub enzymu optymalnej temperaturze ) przez określony okres czasu , a następnie odczytać 96- studzienkowego czytnika płytek. Jeśli wykonanie testu kinetyki , przejdź bezpośrednio do czytania ( patrz poniżej ) . Płytę
5

Włożyć próbki do 96-dołkowych czytnika płytek . Utwórz nową stronę eksperymentować i wejść do menu ustawień. Wejściepoprawne absorbancja (wzbudzenie ) i długości fali emisji , a następnie wybierz odpowiednie dołki do odczytu .

Wykonywania eksperymentu kinetyki , ustawić czas trwania doświadczenia i odczyty okres interwału (np. raz 10 minut) .

zaczniesz czytać próbki .

Analizowanie danych za pomocą funkcji graficznych, w programie Microsoft Excel (lub innego programu graficznego , takiego jak GraphPad ) . Imperium