QuikChange Mutagenezę Protokoły
QuikChange mutagenezy jestmarką zestawu używanego w badaniach biotechnologicznych w celu wywołania mutacji genetycznej lub zmiany DNA . Agilent Technologies tofirma za produkt , który jest dostępny w dwóch wersjach, II i QuikChange QuikChange Lightning. Oba zestawy zawierają roztwór buforowy , polimerazy DNA, enzymu , odczynniki kolor, sekwencje DNA lub starterów i próbek komórkowych . Reakcja syntezy zmutowanego Strand Protokół
Techników syntezy oligonukleotydów lub dwie krótkie sekwencje DNA zawierające pożądaną mutację . Następnie przygotowuje się reakcję z użyciem tej sekwencji DNA , roztwór enzymu mieszanki dNTP i polimerazy DNA , dodając wodę destylowaną . Następnie przygotowuje się serię przykładowych reakcji z zastosowaniem różnych stężeń dwuniciowy DNA ( dsDNA ) , utrzymując startera lub stężenia oligonukleotydów stałej , zgodnie z instrukcjami producenta. Mają próbki na 203 stopni F przez 30 sekund . Próbka DNA zawierający dwa numer segmentu jest również badany w temperaturze rowerowej , techniki , gdzie zmiany temperatury w czasie krótkich okresów czasu . Na koniec próbki umieszcza się na lodzie przez dwie minuty . Łódź
Dpn I Trawienie produktów amplifikacji protokołu
Dpn I enzym restrykcyjny tnie DNA w określonych miejscach. Jeden mikrolitrów tego enzymu dodaje się bezpośrednio do każdej reakcji amplifikacji poniżej standardowej nakładki oleju mineralnego za pomocą pipety lub mikro - specjalistycznego aerozolu odporne końcówki pipety . Jednakżenakładki olej mineralny jest wymagane tylko wtedy,termocykler ,urządzenie stosowane do amplifikacji segmentów DNA nie ma zespołu gorącej górnej . Reakcja jest łagodnie wymieszano i następnie umieszczono w mikro wirówce przez jedną minutę. Następnie próbki inkubowano w 98,6 stopni F przez jedną godzinę. Imperium transformacja komórek XL1 -Blue superkompetentnych Protokół
XL1 - Blue jesttetracyklina linia komórkowa odporna , że pochodzi z zestawów QuikChange mutagenezy . Podczas tego protokołu , technicy rozmrożenie komórek , które wcześniej były przechowywane w -112 stopni F , na lodzie . Następnie dodać jedną mikro litrowe Dpn I- potraktowanego DNA ogrzać do 107,6 stopni F przez 45 sekund, po czym do reaktora w lodzie przez dwie minuty. Po tym zabiegu, technicy dodawać preparat NZY ( hydrolizat kazeiny i ekstrakt drożdżowy ) podgrzewa się do 107,6 stopni F i inkubuje się przez jedną godzinę. Preparat następnie umieścić na płytkach z żelem agarowym i inkubowano w 98,6 stopni F przez 16 godzin . Imperium
