Molecular Cloning Protocols

Molekularne klonowanie protokołów obejmuje procedury stosowane do określenia , izolowanie i replikacji sekwencji DNA. Tradycyjne protokoły restrykcyjnymi i ligacji do klonowania zainicjować fragmentacji DNA w ograniczonych endonukleaz ( enzymów , które tną pasma DNA w miejscach restrykcyjnych ), ligację fragmentów DNA (naprawy nieciągłości w cząsteczkach DNA ) , transfekcji ( wprowadzenia kwasu nukleinowego do komórek organizmu ) i wybór (wyborze poszczególnych genomów do replikacji ) . Izolacja

procedur izolowania fragmentu DNA ,pierwszy etap klonowania molekularnego , często zawierają reakcję łańcuchową polimerazy ( PMR ) , który stosuje się cykle ogrzewania i chłodzenia w celu powielenia fragmentów DNA. W celu uzyskania odpowiedniego rozmiaru sekwencji celem inne protokoły zawierają sonikacji DNA, trawienia enzymatycznego reakcji i użycie syntetycznych oligonukleotydów. Protokoły te są różne w zależności od wielkości i ilości wyizolowanego DNA potrzebne.
Zbiory ligacji

obejmują protokoły ligacji przy użyciu enzymu ligazy DNA do przyłączenia cząsteczki DNA wraz z wiązanie kowalencyjne . Protokół nakazuje łączenie fragmentów DNA , wektor do klonowania , bufor ligacji, ligazy DNA i sterylizuje wodę w probówki i inkubowano przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza . Imperium Odczynniki

protokoły transfekcji lub zaparzanie DNA do komórki z użyciem nie-wirusową, środki często obejmują wstrzyknięcie DNA bezpośrednio do cytoplazmy komórkowej. Inne sposoby obejmują chemiczne za pomocą odczynników , takich jak fosforan wapnia i lipidów , w celu dostarczenia kompleksu transfekcji przez błonę komórkową. Metoda ta sprawdza skutki modyfikacji genetycznej dla funkcjonowania określonych genów .

Wybór

Wybór lub przesiewowych , protokoły określenia komórek, które pomyślnie przeprowadzono wkładki DNA i wskazać których komórki potrzebują izolacji . Wirówce zbiór komórek, które zawierają transfekowane DNA, które są następnie inkubowane w lizozymu (naturalnie występujących enzymów ) i bufor traktowany detergentem alkalicznym , dzięki czemu białka błon i rozpuszczalność . Stosując octan celu wytrącenia białek ,wirówkę i gazę filtr supernatant zawierający DNA (rozpuszczalny pozostałej cieczy z odwirowanej związku ). Supernatant wytrąca się glikol polietylenowy , odwirowano i zawieszono w chlorku cezowego i bromku etydyny w buforze . Bromek etydyny barwi DNA według gęstości i za pomocą światła UV długości fali ,niższej pasma DNA ekstrahuje się pięć ml strzykawki. Zrównoważoną kolumnę jonowymienną oddziela się DNA z bromkiem etydyny i chlorku cezu , akońcowy osad DNA zawiesza się w roztworze buforowym , a wykryta w elektroforezie na żelu agarozowym . Łódź