Kriokonserwacja Procedury
Przegląd
procedury kriokonserwacja są te, które pozwalają na komórki mają być przechowywane na czas nieokreślony za pomocą ekstremalnie niskich temperatur , aby zawiesić działalność metabolicznych . Istnieją dwa główne rodzaje procedur kriokonserwacji : Equilibrium ( konwencjonalny ) i powolne zamrażanie równowagi lub nie- ultra szybkiego zamrażania ( witryfikacji ) . Termin witryfikacja pochodzi od łacińskiego " szkliste " lub szkliste . Obie procedury korzystania krioprotektanty o właściwościach przeciw zamarzaniu typu , aby zapobiec uszkodzeniom komórek podczas procesu zamrażania . Gdy komórki są zamrażane lub zeszkleniu , mogą być przechowywane przez czas nieokreślony , przez zanurzenie ich w ciekłym azocie , bardzo zimnego płynu o temperaturze -196 ° C ( -321 F). W celu przywrócenia aktywności metabolicznej w komórce po rozmrożeniu toksyczne krioprotektanty muszą być usunięte z komory i normalną równowagę wody stopniowo przywróconakomórek wraca do normalnej temperaturze działania.
Komórkowa szczególne czynniki
procedura stosowana do cryopreserve komórki lub tkanki zależy od licznych czynników, takich jak wielkość komórki,ilość płynu ( cytoplazmy komórkowej ) izłożoność komórek (pojedyncze komórki lub tkanki) . Komórki z dużą ilością cytoplazmy jak jajka są trudniejsze do cryopreserve niż komórki z tylko resztkową cytoplazmie , jak plemników . Kriokonserwacja tkanki jajnika jest większym wyzwaniem , ponieważ co najmniej trzy różne typy komórek o różnych rozmiarach są obecne w tkance jajnika, każda z różnych optymalnych potrzeb zamrażania . Protokoły powolnym zamrażania stosowano z powodzeniem z różnymi typami komórek. Witryfikacji jest obecnie najbardziej skutecznym z zamrażania pojedynczych komórek i tkanek mniej skuteczne , ale trwają badania w celu optymalizacji witryfikacji tkanki .
Rola krioprotektanty
cytoplazma komórka zawiera wodę, która zamienia się kryształków lodu w temperaturze zamarzania . Gdy formy lodu wewnątrz komórki ,komórka jest rozdrobnione i umiera . W związku z tym ,płyn w komorze musi być usunięta zanim osiągnie temperaturę zamarzania , aby zapobiec uszkodzeniu komórek. Różne rodzaje przeciw zamarzaniu ( krioprotekcyjnych ) płynów może zostać wykorzystane do odwodnienia przed zamrożeniem komórek , w tym glicerol , propanodiol, sulfoxde dimetylu ( DMSO), cukry , takie jak etanol i sacharoza i trehaloza . Optymalna szybkość chłodzenia ( i rozmrażanie ) zależy od rodzaju stosowanych konserwantu kriogenicznego i od właściwości komórki lub tkanki, która ma być (lub które było) zamrożone. Krioprotektanty są toksyczne dla metabolizmu komórki , więc ekspozycja komórek do krioprotektantów w wyższych temperaturach metabolicznych należy zminimalizować lub uniknąć. Po rozmrożeniu i ogrzaniu komórek , krioprotektanty muszą być całkowicie usunięte z komórki zanim zostanie przywrócona aktywność metaboliczna .
Equilibrium Versus nierównowagi kriokonserwacja postępowania
wynosi zamrażania zależy od tego, czyprotokół zamrażania jest równowaga - lub nie- equilbrium oparte . Dla procedur typu równowagi,optymalna szybkość zamrażania uzyskuje się, gdy istniejerównowaga pomiędzy szybkością , przy którejkomórki wodnieniem wody i szybkości, z jaką woda poza komórką jest przekształcany w etapie lodowej. Te równowagi lub wolno zamrażać protokoły zazwyczaj wiele godzin , aby zakończyć ikomputer jest używany do uruchamiania programowalny zamrażarka stopy , aby zapewnić , że stawki zamarzaniu są dokładnie według potrzeb. Jest to zwykle"trzyma " krok w protokole , w pobliżu początku , aby umożliwić ręczne tworzenie startowych kryształów lodu lub " siewu " w płynie na zewnątrz komórek .
witryfikacji , służyzupełnie inne podejście do zamrażania , który nie opiera się na rampach i osiągnięcia równowagi pomiędzy odwodnieniem i tworzenia kryształków lodu . Witryfikacji jest tak bardzo szybki , że nie ma czasu na tworzenie się lodu ipłyn komórkowy jest konwertowany bezpośrednio do ciała szklistego lub szkła fazy , bez uszkodzenia komórki. Zamrażarki programowalne oprocentowaniu nie są wymagane , ponieważkomórka jest bezpośrednio pogrążyła się w bardzo niskiej temperaturze ciekłego azotu , osiągając chwilową stan szklisty .
Zwolnionym Zamrożenie Procedura
pierwszy etap Procedura powolnego zamrażania jest pokazanie komórkę konserwantu kriogenicznego stopniowe etapowo powoli umożliwiają zrównoważenie komórki z krioprotektant podczas uwalniania wody. Gdy komórki zostały usunięte większości wody komórkową komórek w płynie krioprotekcyjnym umieszcza się w zbiorniku z pewnego rodzaju, takie jak słoma z tworzywa sztucznego, w ampułce szklanej lub plastikowej objętości vial.The płynu otaczającego komórki dla powolne zamrażanie jest zazwyczaj mniej niż łyżeczką i może być tylko kilka kropel . Wstępnie oznaczony pojemnik jest napełniany , zamknięto i umieszczono w zamrażalniku , co programowalnego powoli obniża się temperaturę z pojemnika przez okres minuty lub godziny do bardzo niskich temperatur . Po kilku minutach oziębiania starterowe kryształy lodowe powinny być utworzone w pojemniku przez " wysiewania" pojemnika . Siew przeprowadza się za pomocą narzędzia (na przykład kleszcze ), które zostały wstępnie schłodzonego ciekłego azotu , aby dotknąć pojemnika i powoduje tworzenie kryształów lodu . Ten kryształ startowy rozpocznie kontrolowane powstawanie kryształków lodu w jednym miejscu , w bezpiecznej odległości od komórki . Po zakończeniu wysiewu ,reszta ramp chłodzenia może kontynuować. Gdypojemnik osiąga temperaturę pomiędzy -30 i -85 ° C,pojemnik zawierający komórki może być spadł bezpośrednio do ciekłego azotu , aby zakończyćochłodzeniu do -196 C.
Foto witryfikacji
