Jak rozwiązywać A trzy Fragment podwiązanie

Ligację jestmetoda stosowana w badaniach biologicznych do łączenia oddzielnych nici DNA . Proces został uproszczony przy użyciu dostępnych w handlu zestawów ligacji . Procedura Ligację zazwyczaj następuje transformacja , proces wstawiania złączone DNA do bakterii biorcy wektora do klonowania i amplifikacji DNA. Ze względu na złożoność sposobu, wyników nie odpowiadają pożądanym produktem i wymagają czynności. Jest to większego znaczenia w próbie sprzężenia wiele fragmentów , takie jak w potrójnej ligacji. Rzeczy, które musisz Foto zestawu Ligation
Ligację protokół
żelu agarozowym
50 X TBA bufora ( 242 g zasady Tris , 57,1 ml lodowatego kwasu octowego , 100 ml 0,5 M EDTA rozcieńczyć do 1 litra wodą ) Łódź dejonizowanej wody Zestaw do oczyszczania DNA


Pokaż więcej instrukcji
Rozwiązywanie problemów z transformacji
1

Sformułuj listę etapów ligacji i transformacji . Rozwiązywanie problemów dowolnego protokołu naukowej zazwyczaj rozpoczyna się w końcowym etapie , pracuje w tył.
2

porównania oczyszczony produkt DNA z próbki DNA kontrolnym , dostarczonego w zestawie . Po DNA transformowano i sklonowano w bakteriach , można go wydzielić , oczyszczać i sprawdzane za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wyniki dla elektroforezy wskazywałyby , czy transformacja przebiegła pomyślnie .
3

Określić wzrost bakterii podczas klonowania . Najczęściej wektory bakteryjne są skonstruowane tak, tylko te z insertu DNA - wzrośnie na pożywce zawierającej ampicylinę , lub inne antybiotyki . Słabe tempo wzrostu może ustalić, żepróbka DNA nie został pomyślnie wstawiony do wektora.
4

potwierdzić , żepróbka DNA ligacji oczyszczony przed transformacją . Sole buforujące i enzymy ligacji mogą zahamować przemianę wstawionego DNA. Jest również ważne, aby stwierdzić, żeenzymem ligację inaktywowano przez ogrzewanie , po zakończeniu procedury ligacji . Aktywne ligazy może potencjalnie kolidować z transformacji .
5

Sprawdź datę na magazynie bakteryjne wykorzystywane do transformacji . Stare komórki bakteryjne tracą wydajność w czasie. Ostatecznie komórki bakteryjne są zdolne do transformacji i jakości klonowania. Gdy proces transformacji została zdiagnozowana , można rozpocząć analizowanie procedury ligacji .
Rozwiązywanie Ligację
6

Potwierdź czystość swojej próbki DNA , przed ligacji. Sól zanieczyszczeń w próbce DNA może skutkować słabą ligacji. Próbka DNA powinno być oczyszczone , wolne od soli i enzymy, przed jego zastosowaniem ligacji .
7

potwierdzić czy końce nici DNA , które mają być ligowane są tępe lub lepkie. Ligacja służy do łączenia oddzielnych nici z tępymi końcami lub lepkie końce , po trawieniu enzymami restrykcyjnymi wyznaczonych . Ligazy T4 DNAenzymem z wyboru do tępych końców DNA - ale również pracować DNA o lepkich końcach. Inne ligazy DNA może działać tylko na DNA , w następstwieograniczenia trawienia stworzyć lepkie końce . Ważne jest zastosowanie odpowiedniego ligazy dla badanego DNA.
8

Sprawdź Stężenie próbek DNA przed podwiązaniem . Przy użyciu DNA o wysokiej koncentracji często powoduje się liniowy DNA . Instrukcje zestaw dostarczy informacji na temat prawidłowej ilości DNA do użycia w reakcji ligacji .
9

Wymień enzymu ligazy z nowej partii . Enzymy są szczególnie wrażliwe na temperatury pokojowej i kontynuowano cyklach zamrażania- rozmrażania . Ligazy może być uszkodzony w wyniku wielu zastosowań i łatwo, przez zamrażanie i rozmrażanie zbyt wiele razy. Niektóre zestawy zalecają ligazy być rozdzielany do mniejszych porcji w początkowej fazie , aby zmniejszyć liczbę razy był ponownie zamrożone .
10

Sprawdź zestaw do wiązania . Częstoproblem z ligacji używa zestawu , który wygasł lub został zanieczyszczony innymi DNA i soli . Imperium