Instrukcje western blot

Analiza Western blot jestdobrze znaną techniką do identyfikacji konkretnych białek izolowanych z tkanki . Poszczególne białka oddzielana od ładunku i ciężaru na żelu poliakrylamidowym z SDS i przeniesiono na błonę nitrocelulozową. Po przeniesieniu znakowane przeciwciała wiążą się specyficznie z pożądanym białkiem i sfotografowane przy użyciu kliszy rentgenowskiej lub uwidoczniono białka specyficzne dla barwnika. Wynik końcowy pokazuje ciemny pasm wskazujących obecność zidentyfikowanego białka. Ten artykuł skupia się na podstawowej metodologii przeprowadzania analizy Western blot w laboratorium zakwalifikował się do kompleksowych badań białka . Rzeczy, które musisz
żelu SDS- poliakrylamidowym ( SDS-PAGE ), z separacji białek
nitrocelulozowe membrany Obrazów wody destylowanej
transferu bufor ( 30 g Tris , 144 g glicyny i 200 ml metanolu w 1 l wody )
Bibuła filtracyjna , Whatman 3 mm
gąbka Laboratorium
Western Blot komorze przejściowej Obrazów zasilacz laboratoryjny
Laboratorium Laboratorium chłodnicy Obrazów mieszadła
roztwór soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) ( 24,2 g zasady Tris , 80 g NaCl w 1 l wody )
Blokowanie rozwiązanie ( 5 procent beztłuszczowe mleko w proszku w TBS )
roztwór przeciwciała pierwotne
Oznaczone roztwór koniugatu przeciwciało
roztwór substratu fosfatazy alkalicznej z nitro niebieski tetrazoliowa plama
bufor fosforanowy ( PBS ) Foto pole Gel- imager

Pokaż więcej instrukcji
Przelew proteiny nitroceluloza Membrane
1

Przygotowanie membrany nitrocelulozowe. Membrana powinna być moczone w wodzie przez dwie minuty, a następnie umieszczane w buforze do przenoszenia i pozostawia do nasiąknięcia przez pięć minut.
2

Zestawić sandwich przenoszącego składającego się z papieru gąbka /filtr /PAGE z SDS /papier membrana nitroceluloza /filtr /gąbka . Sandwiczowa jest tak ustawione,membrana leży bliżej anody iżel bliżej katody w komorze przenoszenia.
3

Dodaje się bufor przenoszenia w komorze taksandwiczowa jest zanurzona. Umieść komorę wewnątrz laboratoryjnej lodówce . Transfer białek z żelu na membranę należy przeprowadzić w 4 stopniach Celsjusza.
4

Konfiguracja zasilacz do przesyłania białek z żelu na membranę . Kierunek przekazywania jest w kierunku wskazanym przez anodę tego przewodu . Większe Białka poruszają się szybko w reakcji na elektryczny prąd i pierwszy ruch . Zasilacz kontroluje szybkość transferu. Ustaw moc 30 V i 40 mA dla transferu przez noc.
5

Zdemontować zasilacz po zakończeniu transferu. Nie kontaktuje się z bufora transferu lub usunięcia kanapkę podczas gdy zasilacz jest przyłączony .
6

Wyjąć membranę z kanapki i inkubować przez dwie godziny w roztworze blokującym . Białka w roztworze blokującym zaabsorbuje się do membrany , gdy nie są obecne białka . Będzie on zapobiegać wiązaniu przeciwciała do błony , gdzieżądane białko nie występuje .
Wiązanieprzeciwciała
7

Inkubować błony nitrocelulozowy z roztworu podstawowego stosującprzeciwciała mieszadło . Membrana powinna być całkowicie zanurzona w roztworze przez co najmniej jedną godzinę. Dopuszczalne jest inkubować przez noc .
8

dokładnie umyć membranę celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Cztery odrębne przemycia 10 minut w TBS są zwykle wystarczające do usunięcia nadmiaru przeciwciała.
9

Inkubować błony w roztworze znakowanego koniugatu przeciwciało stosując mieszadło . Membrana musi być inkubowane przez co najmniej jedną godzinę . Znakowanego koniugatu przeciwciało związane jest z fosfatazą alkaliczną. Topołączenie enzym -przeciwciało , które rozpoznaje i wiąże się z pierwszym przeciwciałem.
Wykrywanie białka

10

Przepłukać błony przez 10 minut w PBS czterokrotnie . Spowoduje to usunięcie pozostałej części oznaczonej koniugatu przeciwciał.
11

Inkubować w membranę roztworu substratu fosfatazy alkalicznej , aż pojawi się wzory band . Barwnika w roztworze substratu będzie wiązać się do przeciwciała - antygenu białka w membranie i stanowią zespół o barwie ciemnej . Proces ten może być bezpośredni lub wymagać do 30 minut przed zachowane są zespoły .
12

całkowicie błonę owinąć w celofan i umieścić go bezpośrednio na żelu kamerze do wizualizacji wyników . Żel - kamera jest w stanie fotografować wyników wyświetlanych na Western blot membranę . Imperium