Jak zmierzyć żywotność komórek

W większości eksperymentów biologicznych dotyczących hodowli komórek ,krytyczny etap obejmuje wiedząc , które komórki są żywe i które są martwe w próbce . Wykluczenie barwnika jestnajbardziej popularna metoda pomiaru żywotności komórek . Wykluczenia barwnika na podstawie teorii, że zawiera nienaruszone komórki żywe i martwe komórki błony nie , w ten sposób komórki martwe pochłaniania barwnika do cytoplazmy. Istnieją różne barwniki i protokoły i metody wybrać powinny być oparte na kosztach , czułość , łatwość i długość postępowania . Błękitu jesttypowy barwnik wykorzystywany do pomiaru żywotności komórek , ponieważprocedura może być wykonane w pięć do 10 minut, a koszty tylko ilość odczynnika barwiącego . Rzeczy, które musisz
błękitu trypanowego 0,4 % odczynnika
hemacytometr Obrazów Okładka poślizgu
mikropipeta Obrazów Końcówki
bufor fosforanowy ( PBS ) na Twitterze mikroskopem
Zobacz więcej instrukcji
1

Uzyskanie osad komórek jesteś pomiarowych .
2

Zawiesićosad komórek w PBS , aby uzyskać około 5 x 105 komórek /ml . PBS stosowany, ponieważ pomiar żywotności bardziej dokładna, gdy komórki są w środowisku bez surowicy ; białka surowicy może również plamić i daje błędne wyniki .
3

Dodaj równe części zawiesiny komórek w PBS do równych części 0,4 % błękitem trypanowym , aby uzyskać 1 do 2 rozcieńczenia (przykład : . 100 ul komórek na 100 ul z błękitem trypanu ) i wymieszać przez pipetowanie
4

Inkubować mieszaninę przez mniej niż trzy minuty w temperaturze pokojowej . Jeśli komórki są liczone po około pięciu minut , żywotność będzie niedokładny z powodu śmierci komórek .
5

Z poślizgu okładki już w miejscu , wypełniając każdą stronę licznika przedmiotowym hemocytometru z zawiesiny komórek . Zazwyczaj każda strona będzie od 10 do 20 ul .
6

Umieść hemacytometr na scenie mikroskopem świetlnym i skupić się na komórki .
7

każdej strony hemacytometr zawiera wiele kwadraty . Policzyć całkowitą liczbę komórek w jednym placu hemacytometrze . Następnie policzyć nieżywotnego (niebieski) i żywotne komórki (wyczyść) oddzielnie , w tym samym placu .
8

Obliczyć procent żywych komórek na placu przez podzielenie liczby żywych komórek przez liczbę wszystkich komórek i mnożąc przez 100 . Zrób to dla wielu placów na hemacytometrze uzyskać średnią pomiaru żywotności . Imperium