Jak wykryć NADH

nikotynamid adenina dinuceltoide ( NADH ) , w skrócie "Nad " , jestkoenzym się w żywych komórkach , które wytwarza reakcje chemiczne w białkach . Firmy farmaceutyczne badanie NADH powodu procesie metabolizmu i syntetycznie utworzyć z wielu celów. Od NADH jest mikroskopijna ,gołym okiem nie można dostrzec go . Musisz badań naukowych oraz zestaw testowy do wykrywania jego obecności . Rzeczy, które musisz
Suchy lód Foto Micro - wirówek Zbiory Eppendorf rur

Pokaż więcej instrukcji
Odczynnik Odtworzenie
1

Ustaw bufor na rowerze licznik i umożliwićbuforu do osiągnięcia temperatury pokojowej. Idealna temperatura w buforze jest 22 stopni Celsjusza .
2

Rozpuścić rowerowej mieszankę enzymów NAD z dokładnie 220 ​​mikrolitrami buforze rowerowej . Zamrażać roztworu w temperaturze poniżej -70 stopni Celsjusza .
3

Rozpuścić dewelopera NADH 1,2 ml ddH2O . Delikatnie wymieszać roztwór aż do całkowitego rozpuszczenia. Nie wir .
4

średnia Rozpuścić NADH 200 mikrolitrami czystej dimetylosulfotlenku .
Przygotowanie próbki
5

Przepłukać komórki roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem .
6

peletki 2x10 ( 5 ), komórki dla poszczególnych teście do probówki mikro wirówkowej i działają przy 2000 obrotach na minutę przez 5 minut .
7

wyodrębnić komórki 400 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego NAD /NADH przez zamrażanie i rozmrażanie komórek w dwóch cyklach - 20 minut na suchym lodzie i 10 minut w temperaturze pokojowej. Vortexekstrakcji komórek dokładnie 10 sekund.
8

wirowania próbek komórek w mikro- wirówce przy 14000 RPM przez dokładnie 5 minut.
9

Przenieść NAD /komórki NADH do czystej probówki .
Protokół testu
10

Rozcieńczyć 10 mikrolitrów standardu NADH z 990 ml buforu do ekstrakcji NAD /NADH . Dodać 0, 2 , 4, 6 , 8 , 10 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu w 96 -studzienkowej płytce w dwóch powtórzeniach do tworzenia 0, 20 , 40 , 60 80, 100 oraz standardu . Wypełnienie ostatniej studzienki z 50 mikrolitrami buforu ekstrakcyjnego NAD /NADH .
11

Przelew 50 mikrolitrów ekstrahowanych próbkach komórek do 96 -studzienkowej płytce w dwóch powtórzeniach , jak poprzednio.
12

Przygotowanie próbek komórkowych do wykrywania NADH . Rozłożenie NAD z próbek komórek przez wprowadzenie 200 mikrolitrów ekstrahowanych próbkach komórek do probówek Eppendorfa . Ogrzać do rurek 60 stopni Celsjusza przez 30 min do łaźni wodnej o regulowanej temperaturze . Szybkie ochłodzenie próbek przez umieszczenie rurek na lodzie. Wirować próbek w mikro wirówce w celu usunięcia substancji wytrąconych . Przeniesienie 50 mikrolitrów rozłożonej próbek do 96 dołkach w dwóch powtórzeniach , jak wcześniej.
13

Wymieszać mieszankę bufora rowerowej NAD 100 mikrolitrami NAD mieszanki buforowej rowerowej i 2 mikrolitrami NAD enzymu rowerowej . Dodać 100 mikrolitrów tego nowego rozwiązania w każdej studzienki i próbki norm NADH .
14

Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez dokładnie 5 minut. Ten proces konwersji NAD do NADH .
15

Dodaj 10 mikrolitrów NADH autora do każdego dobrze . Pozwalająpłyta siedzieć w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę i maksymalnie 4 godziny.
16

Czytaj płytę i obliczyć NADH .