Biotynylacja powierzchni komórkowej protokół

Biotynylacja wykorzystuje zdolność rozpuszczalnej witaminy biotyny do wiązania białek komórkowych. Biotyna wiąże się z streptawidyna białka , a zatem , użyteczne w biologii komórki do wizualizacji białek komórkowych. Biotynylacja umożliwia bezpieczne oznaczanie białka w porównaniu do technik takich jak radioaktywności i nie wpływa na komórki normalne funkcjonowanie . To pozwala naukowcom badanie białek komórkowych , takich jak receptory , i że pozwala na lepsze zrozumienie chorób i procesów chorobowych . Znakowania komórek zawieszonych

komórki Mycie w lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem ( PBS ) w celu usunięcia zanieczyszczeń . Bufory zawierające tris i glicyny będzie konkurować z biotynylacji i należy go unikać . Aby uniknąć biotynylowanie białka wewnętrzne ,opakowanie może być wykonane w 4 stopniach Celsjusza lub w obecności azydku . Komórki zawiesza się w PBS i rozpuszczalnego biotyną sulfo -NHS -LC- biotyny . Łódź
Znakowanie komórek adherentnych

Komórki przemywa się w PBS i inkubuje się z produktem , takim jak sulfo -NHS -LC- biotyny . Komórki są następnie ociera do naczynia i lizie w buforze zawierającym detergent Triton -X 100 i przygotowany do wizualizacji . Imperium Przygotowanie znakowanych komórek

Po inkubacji , komórki odwirowuje się osadu i przemyto w PBS. Komórki zawieszono w PBS i oczyszczono z żelu Sepharose IgG . Związane białko rozcieńczono w buforze ładującym i ogrzewano do 100 stopni Celsjusza.
Wywołujący komórki

Rozcieńczone białka mogą być wizualizowane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z siarczanem dodecylu sodu (SDS - PAGE ), a następnie przez suszenie w białka i mieszanki enzymu , nadtlenek streptawidyny z chrzanu . Plamy są wizualizowane w reakcji chemicznej --- chemiluminescencji --- emitującej światło . Specyfika biotynylację można potwierdzić z przeciwciał dla białka objętych badaniem. Imperium