Jakimi metodami można badać interakcje białko-białko?
Do badania interakcji białko-białko można zastosować kilka metod. Oto kilka powszechnie stosowanych technik:
1. Koimmunoprecypitacja (Co-IP) :Co-IP jest szeroko stosowaną techniką badania interakcji białko-białko. Polega na immunoprecypitacji jednego białka (białka przynęty) z lizatu komórkowego przy użyciu przeciwciała specyficznego dla białka przynęty. Następnie analizuje się immunoprecypitowany kompleks białkowy w celu zidentyfikowania innych białek (białek ofiary), które oddziałują z białkiem przynęty. Po Co-IP można zastosować różne dalsze metody analizy, takie jak Western blot, spektrometria mas lub barwienie immunofluorescencyjne.
2. Testy pull-down :Testy pull-down opierają się na zasadzie chromatografii powinowactwa. Białko przynęty unieruchamia się na stałym nośniku (takim jak kulki magnetyczne lub żywica agarozowa) poprzez wiązanie kowalencyjne lub fuzję ze znacznikiem (np. GST lub His-tag). Lizat komórkowy lub oczyszczoną mieszaninę białek inkubuje się następnie z unieruchomionym białkiem przynęty. Po przemyciu w celu usunięcia niezwiązanych białek, białka oddziałujące (białka będące ofiarą) są eluowane i analizowane.
3. Transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) :FRET to technika pomiaru transferu energii pomiędzy dwoma blisko siebie rozmieszczonymi fluoroforami (donorem i akceptorem). Kiedy fluorofory donora i akceptora znajdują się blisko siebie (zwykle w odległości 10-100 Å), wzbudzenie fluoroforu donora powoduje emisję światła przez fluorofor akceptora. Ten transfer energii można określić ilościowo i wykorzystać do monitorowania interakcji białko-białko. FRET można wdrożyć na różne sposoby, w tym poprzez znakowanie białek specyficznymi fluoroforami lub przy użyciu genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych (np. GFP i RFP).
4. Analiza interakcji biomolekularnych (BIA) :BIA, znany również jako powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), to technika niewymagająca oznakowania, która mierzy zmiany współczynnika załamania światła na styku szkiełka i przepływającej cieczy. Jedno z oddziałujących białek zostaje unieruchomione na powierzchni szkła, drugie zaś przepuszczane jest po powierzchni. Interakcja między białkami prowadzi do zmian współczynnika załamania światła, które można wykryć i określić ilościowo. BIA może dostarczyć informacji na temat powinowactwa wiązania i kinetyki interakcji białko-białko.
5. Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) :ITC to technika pomiaru zmiany ciepła związanej z interakcją między dwiema cząsteczkami. Kiedy białka oddziałują, ciepło jest uwalniane (egzotermia) lub absorbowane (endotermia). ITC może określić ilościowo powinowactwo wiązania (Kd) i parametry termodynamiczne, takie jak zmiana entalpii (ΔH) i zmiana entropii (ΔS) interakcji białko-białko.
6. Macierze interakcji białek :Macierze interakcji białek obejmują wysokowydajne badanie przesiewowe interakcji białko-białko w formacie mikromacierzy. Tysiące różnych białek lub peptydów unieruchamia się na stałej powierzchni, a wiązanie konkretnego białka będącego przedmiotem zainteresowania wykrywa się przy użyciu znakowanych przeciwciał lub innych metod wykrywania. Technika ta pozwala na szybką i zakrojoną na szeroką skalę analizę interakcji białko-białko.
7. Test dwuhybrydowy drożdży (Y2H) :Test Y2H jest metodą genetyczną stosowaną do identyfikacji interakcji białko-białko w komórkach drożdży. Polega na fuzji sekwencji kodujących dwa białka z dwiema różnymi domenami czynnika transkrypcyjnego. Jeśli te dwa białka oddziałują, czynnik transkrypcyjny zostaje odtworzony, co prowadzi do ekspresji genu reporterowego. Pozytywne interakcje identyfikuje się na podstawie wzrostu komórek drożdży na pożywkach selektywnych lub w testach kolorymetrycznych.
Wybór metody badania interakcji białko-białko zależy od konkretnych białek będących przedmiotem zainteresowania, dostępności odczynników i sprzętu oraz pożądanego poziomu informacji. Można również zastosować kombinacje tych technik, aby uzyskać kompleksowy wgląd w interakcje białko-białko.
